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MLPA法の原理

MLPA法(コピー数異常の検出)

1. プローブの設計

MLPA法では、まず、それぞれターゲットとする遺伝子(領域)に対して特異的に結合する隣接した2つのプローブを用います。また、各プローブにはユニバーサルプライマーによるPCR増幅を可能にする共通配列を結合させ、さらに、スタッファーシーケンス(サイズ調節塩基配列)を融合させることで、それぞれ異なる増幅断片長になるように設計されています。

2. プローブのハイブリダイゼーションとライゲースによる一本化

標的遺伝子配列にハイブリダイズした隣接する2つのプローブは、ライゲースにより連結され一本化されます。プローブは、遺伝子ごと、exonごとでターゲットを設定することが可能です。

3. PCRによる増幅

連結化プローブを標的遺伝子から遊離させ、さらに、ユニバーサル蛍光標識プライマーでPCR増幅を行います。このPCRによって、異なる連結化プローブの長さに従った、さまざまな長さの増幅断片が得られます。

4. フラグメント解析

PCRで得られたそれぞれの増幅断片は1領域ごとで長さが異なっているので、電気泳動解析によって検出されるシグナルは、各領域に対応しています。また、ピーク面積は連結化プローブ(標的遺伝子領域)の存在量を反映しております。その結果、遺伝子(exon、染色体)の欠失・重複やメチル化、既知の変異を部位特異的にかつ定量的に捉えることが可能になります。

欠失例(1コピー):
連結化特異プローブ量が正常の半分に減少した結果、PCR増幅産物量も約半分程度(65%以下)に減少します。

挿入・重複例(3コピー):
連結化特異プローブ量が正常の1.5倍に増加した結果、PCR増幅産物量も約1.5倍程度(135%以上)に増加します。

※双方のアレルでターゲット領域に変異が生じている場合、また性染色体上に1コピーしかない遺伝子がターゲットの場合は、PCR増幅産物が消失するか、倍加するかの変化を示します。

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メチル化解析 Methylation-specific MLPA® (MS-MLPA®)

MS-MLPA法では、プローブ設計領域のメチル化を半定量的に、かつマルチプレックスに検出することができます。また、1回の実験で、メチル化に加えコピー数解析(通常のMLPA法)を同時に実施できます。

ハイブリダイゼーション後、コピー数解析用とメチル化解析用にチューブを分け、ライゲーション反応と同時にメチル化感受性制限酵素HhaⅠで処理し、PCR反応を行います。

メチル化領域プローブ のPCR産物は、ピークシグナルとして検出されます。(矢印) ピークは相対的にメチル化量を反映しています。

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既知の変異・SNPsの検出

MLPA法では、プローブを既知の点変異・SNP上に設計することで、それらを特異的に検出することができ、わずか1塩基の配列の違いでも識別可能です。
また、1回の実験でコピー数解析(通常のMLPA法)を同時に実施できます。

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